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        免疫印跡膜(PVDF膜)的知識分享

         更新時間:2023-08-14    點擊量:3788

        一、免疫印跡膜的介紹

        Western blotting實驗中,NC膜和PVDF膜是最chang用的兩種膜。NC膜是特異性轉移介質之一,使用范圍十分廣泛,也是最早用于Western blotting實驗的膜。PVDF膜是在1985年開發出來的,它能在比較苛刻的條件下(比如在酸性或堿性條件下,或者在有機溶劑存在時)將蛋白保留,因此更廣泛用于Western blotting實驗中。

        二、作用機理的介紹

        1.  NC

        NC膜與蛋白質之間是依靠靜電作用和疏水作用相結合的,NC膜屬于親水膜,使用前無需進行預活化,使用方便、價格低廉、對蛋白質的活性影響小、背景低;但其韌性較差,易損壞,從而不能反復使用,如果在非離子型去污劑作用下,結合上的蛋白比較容易被洗脫下來。

        2.  PVDF

        PVDF膜與蛋白質之間是依靠疏水作用相結合的,與NC膜相比,PVDF膜有著ji好的化學穩定性和更高的機械強度,適合反復檢測(reprobing)和多次剝離(stripping)。PVDF膜需要先用甲醇潤濕后才能被常規的轉膜液所浸潤,轉印緩沖液中添加的Ca2+離子能夠增強鈣調蛋白與Immobilon®-P轉印膜的結合,鈣的結合使蛋白質分子形成一個疏水袋結構,從而增加蛋白與膜的結合。此外,PVDF膜具有更高的蛋白結合能力,一般NC膜的結合能力是80-100μg/cm2,而PVDF膜可以達到150-160μg/cm2。因此,PVDF膜已成為現階段實驗室WB的常用膜。

        三、PVDF膜使用須知

        1. PVDF膜為什么需預先活化?

        PVDF膜本質上是一種疏水性的聚合物,不帶電荷并具有疏水性,不能被常規轉膜液所浸潤,為了在水性緩沖液中使用,需要在使用前進行預處理以浸潤和活化膜。最chang用的方法是使用50%v/v)或更高濃度的醇(甲醇、乙醇和異丙醇)溶液進行浸潤和活化,使得PVDF膜中微孔內的空氣能夠被低表面張力的甲醇所替代,從而易于后續緩沖液進入PVDF膜中的微孔內,使得PVDF膜從疏水性轉變為親水性,在浸潤過程中膜的外觀會從不透明轉變為半透明,此時表明PVDF膜已被wan全浸濕。然后用水反復沖洗以去除醇類,再直接將膜放入轉印緩沖液中進行平衡。膜被浸濕后,通過電轉移,蛋白質與膜接觸發生疏水作用而被吸附在PVDF膜上。

        2. PVDF膜孔徑對蛋白結合的影響?

        膜孔徑越小,膜對低分子量的蛋白結合就越牢固。首先,較小的孔徑會限制蛋白分子的運動,減緩其轉移速度,蛋白與膜的結合就更充分,從而更容易被攔截在孔道內;其次,較小的孔徑還能提供較大的膜表面積,從而提高了蛋白與膜接觸的機會;此外,較小的孔徑也能提供更高的表面密度,從而增加了孔道與溶液間的分子間吸引力,這種吸附方式被稱為毛細作用"SchweitzerKriz在一項研究中發現,較小的孔徑可以增強其吸附能力并提供更高的蛋白密度,蛋白分子量越低,蛋白的比表面積越大,與膜接觸面越大越充分,結合就更緊密。但是,如果膜的孔徑小于0.1 μm,那么蛋白的轉移就很難進行下去了,是因為蛋白質分子的直徑大約在1-100 nm之間。

        3. 如何選擇PVDF膜?

        一般情況下,分子量大于20kD的蛋白應選擇0.45μm的膜,分子量小于20kD的蛋白應選擇0.2μm的膜。0.2μmPVDF膜內部表面積大約是0.45μmPVDF膜的三倍,因此其吸附能力更高。總之,選擇PVDF膜的孔徑大小需要根據樣品蛋白的特性和大小來確定,以期獲得最佳的結合效果。

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