巨噬細(xì)胞是機(jī)體免疫系統(tǒng)的重要細(xì)胞成分，具有抗感染、抗腫瘤和參與免疫應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)功能。腹腔巨噬細(xì)胞多游離存在于腹水中易于獲得。因此，可以通過(guò)向小鼠腹腔內(nèi)注射刺激物制造無(wú)菌炎癥環(huán)境以積聚巨噬細(xì)胞，來(lái)進(jìn)行巨噬細(xì)胞研究。那么巨噬細(xì)胞的提取和分離方法是什么呢？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、材料

小鼠，SPF級(jí)，體質(zhì)量18～22 g，雄性，6～8周齡。

二、肉湯制備

1. 6%淀粉肉湯制備

將1.0g胰蛋白胨、0.3g牛肉浸膏和0.5g氯化鈉放入盛有100 mL雙蒸水的燒杯中，置于磁力攪拌器常溫溶解后121℃滅菌30min，于4℃保存。

2. 3%巰基乙酸鹽肉湯的制備

1L雙蒸水中加入29g巰基乙酸鹽，煮沸使其wan全溶解，玻璃瓶或離心管分裝后121℃滅菌15min，4℃保存，使用前確保已經(jīng)冷卻。

三、巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)

每次腹腔注射3%巰基乙酸鹽肉湯1mL，每天1次，3d后用預(yù)冷PBS灌洗腹腔2次。

四、巨噬細(xì)胞的收集

準(zhǔn)備75%乙醇，以脫頸方式處死小鼠，浸泡3min。取出，置于無(wú)菌操作臺(tái)，仰臥位固定小鼠，右手持注射器于右下腹部將針頭刺入皮下進(jìn)入腹腔，將5mL預(yù)冷的PBS(培養(yǎng)液組為5mL預(yù)冷的10%血清RPMI 1640培養(yǎng)液) 注入腹腔，按摩小鼠腹部5min。無(wú)菌條件下剪開(kāi)小鼠腹部皮膚顯露胸腹部，用無(wú)菌止血鉗提起劍突處組織，無(wú)菌剪刀在該處剪開(kāi)約1mm2小口。注意止血鉗保持提起狀態(tài)，用無(wú)菌巴氏吸管從腹腔開(kāi)口深入腹腔，反復(fù)沖洗腹膜腔灌洗液2次，可回收約8mL 淡黃色灌洗液。

五、巨噬細(xì)胞的純化與培養(yǎng)

將每只小鼠的灌洗液于常溫條件下1000r /min 離心10min，所得細(xì)胞沉淀用ＲPMI 1640培養(yǎng)液重懸接種，培養(yǎng)體系于37℃靜置培養(yǎng)2～3h后洗去未貼壁細(xì)胞，余下的貼壁細(xì)胞即為巨噬細(xì)胞

六、巨噬細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及計(jì)數(shù)

細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24h后在倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞形態(tài)。用0.5%胰酶消化細(xì)胞，離心棄上清液，PBS重懸得到細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)每只小鼠腹腔中分離的巨噬細(xì)胞數(shù)量。

七、臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)巨噬細(xì)胞活性

將500μL的各組巨噬細(xì)胞懸液和500μL臺(tái)盼藍(lán)染液(0.4%濃度) 加入3.5cm培養(yǎng)皿，搖勻后靜置3～8min; 吸取1滴混合液滴入載玻片，3min內(nèi)鏡下計(jì)數(shù)巨噬細(xì)胞200個(gè)，分別統(tǒng)計(jì)活/死細(xì)胞數(shù)目(死細(xì)胞呈藍(lán)色，活細(xì)胞無(wú)色透亮) ; 細(xì)胞活性(%) = 活細(xì)胞數(shù)/200×100%。每組檢測(cè)重復(fù)3次。

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