影響轉(zhuǎn)染效率的因素及注意事項(xiàng)有什么？

細(xì)胞轉(zhuǎn)染是指將外源遺傳物質(zhì)（DNA或RNA）導(dǎo)入真核細(xì)胞的技術(shù)。 細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)可分為兩大類(lèi)，一類(lèi)是瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，一類(lèi)是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。那么你知道影響轉(zhuǎn)染效率的因素及注意事項(xiàng)有什么嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、轉(zhuǎn)染試劑

不同細(xì)胞系轉(zhuǎn)染效率通常不同，因此在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前需要根據(jù)細(xì)胞特性選擇合適的轉(zhuǎn)染試劑?？梢酝ㄟ^(guò)已發(fā)表文獻(xiàn)和轉(zhuǎn)染試劑提供的已成功轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株來(lái)進(jìn)行選擇。

二、細(xì)胞狀態(tài)

轉(zhuǎn)染前細(xì)胞活力和總體健康狀況是轉(zhuǎn)染產(chǎn)生變異性的重要來(lái)源。一般建議在轉(zhuǎn)染前至少24小時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，以確保細(xì)胞在傳代后處于轉(zhuǎn)染的最佳生理?xiàng)l件，細(xì)胞活力大于 90%。最shi合轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是復(fù)蘇經(jīng)過(guò)幾次傳代后達(dá)到指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，最容易轉(zhuǎn)染。為確保轉(zhuǎn)染的重復(fù)性，一般選擇低細(xì)胞代次（<30，能確?；蛐筒蛔儯?。如果發(fā)現(xiàn)同一株細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率降低，可以嘗試重新復(fù)蘇細(xì)胞以恢復(fù)最佳結(jié)果。此外，污染會(huì)嚴(yán)重影響轉(zhuǎn)染結(jié)果。

匯合度：轉(zhuǎn)染時(shí)過(guò)高或者過(guò)低的細(xì)胞密度會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率降低，乃至表達(dá)水平偏低。因此要根據(jù)具體的細(xì)胞類(lèi)型、應(yīng)用和轉(zhuǎn)染技術(shù)，來(lái)優(yōu)化確定相應(yīng)的最佳密度。如使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時(shí)，貼壁細(xì)胞一般達(dá)到 70%-90% 的匯合度，懸浮細(xì)胞達(dá)到 5 ×10⁵ 至 2 ×10⁶ 個(gè)細(xì)胞/mL 的密度，即可獲得良好的結(jié)果。但不同的轉(zhuǎn)染試劑，針對(duì)不同細(xì)胞系要求轉(zhuǎn)染時(shí)的最適細(xì)胞密度各不相同，因此使用新的細(xì)胞系或者新的轉(zhuǎn)染試劑時(shí)，應(yīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)優(yōu)化并建立一個(gè)穩(wěn)定方法，包括適當(dāng)?shù)慕臃N量和培養(yǎng)時(shí)間等等。不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊矔?huì)影響轉(zhuǎn)染時(shí)的鋪板密度，比如研究細(xì)胞周期相關(guān)基因等表達(dá)周期長(zhǎng)的基因，就需要較低的鋪板密度，所以需要選擇能夠在較低鋪板密度下進(jìn)行轉(zhuǎn)染的試劑。

三、培養(yǎng)基

不同的細(xì)胞或細(xì)胞類(lèi)型都有非常特定的培養(yǎng)基、血清、補(bǔ)充劑要求，選擇最shi合細(xì)胞類(lèi)型的培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)染方法在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中起著非常重要的作用。一些細(xì)胞系和原代細(xì)胞可能需要特殊的包被材料（如多聚賴(lài)氨酸、膠原蛋白、纖連蛋白等）以附著于培養(yǎng)板并獲得最佳的轉(zhuǎn)染結(jié)果。

可參考已發(fā)表文獻(xiàn)或細(xì)胞來(lái)源處獲得獲得針對(duì)特定細(xì)胞類(lèi)型的合適培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)染方法，如果沒(méi)有相關(guān)信息，則需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)或篩選實(shí)驗(yàn)確定。

四、血清

一般培養(yǎng)基中存在血清可增強(qiáng) DNA 轉(zhuǎn)染。但使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染時(shí)，一些血清蛋白會(huì)干擾復(fù)合物的形成，因此應(yīng)在無(wú)血清條件下制備DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物。當(dāng)使用 RNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞時(shí)，建議在無(wú)血清條件下轉(zhuǎn)染，以避免潛在的RNase污染。

五、抗生素

一般用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的培養(yǎng)基中可含抗生素。不過(guò)，由于陽(yáng)離子脂質(zhì)體試劑可增加細(xì)胞通透性，因此也可能增加遞送到細(xì)胞內(nèi)的抗生素量，從而導(dǎo)致細(xì)胞毒性以及較低的轉(zhuǎn)染效率。因此不建議在轉(zhuǎn)染培養(yǎng)基中加入抗生素?？稍谵D(zhuǎn)染前鋪板細(xì)胞時(shí)，使用無(wú)抗生素的培養(yǎng)基。

對(duì)于穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，不應(yīng)在選擇性培養(yǎng)基中使用青霉素和鏈霉素，因?yàn)檫@些抗生素是 Gibco Geneticin 選擇性抗生素的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。在構(gòu)建穩(wěn)定的細(xì)胞系時(shí)，在轉(zhuǎn)染程序后預(yù)留 48-72 小時(shí)供細(xì)胞表達(dá)抗性基因，之后再加入選擇性抗生素。

六、轉(zhuǎn)染分子類(lèi)型

質(zhì)粒 DNA 是最chang用的轉(zhuǎn)染載體。質(zhì)粒 DNA 的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)（線(xiàn)性或超螺旋）和大小會(huì)影響轉(zhuǎn)染的效率，超螺旋質(zhì)粒 DNA 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的效率zui高。在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染中，相對(duì)于超螺旋 DNA，雖然使用線(xiàn)性 DNA 會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的 DNA 攝取量較低，但 DNA 整合到宿主基因組中的效果更優(yōu)。雖然寡核苷酸、RNA、siRNA 和蛋白質(zhì)等其他大分子也可以轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，但在使用這些大分子時(shí)，需要優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件。

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