你知道什么是Sanger雙脫氧鏈終止法嗎？

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一、原理

Sanger雙脫氧鏈終止法是第一代測序技術中最為經(jīng)典的一種。其巧妙的利用DNA復制原理,利用ddNTP來部分代替常規(guī)的dNTP作為底物進行DNA合成反應。在DNA合成時,一旦ddNTP參入到合成DNA鏈中,由于ddNTP脫氧核糖的3’-位碳原子上缺少羥基，而不能與下一位核苷酸的5’-位磷酸基之間形成3’,5’-磷酸二酯鍵，從而使得正在延伸的DNA鏈在此ddNTP處終止。

二、實驗步驟

1. 將待測序測序的DNA片段進行PCR擴增，得到充足的DNA模版用于進行測序。

得到的DNA模板需要進行純化，需要確保去除所有雜質(zhì)，包括DNA片段、蛋白質(zhì)、RNA等。

2. 根據(jù)待測序列的特點與實驗要求，設計一些特定的引物。

一般來說，通用引物的長度以15～30bp為宜。

3. 合成標記物。標記物是指示測序反應是否成功的物質(zhì)，通常是一種熒光染料或放射性同位素。

4. 將DNA模板、引物、DNA聚合酶和標記物等物質(zhì)混合在一起，進行測序反應。

在反應過程中，DNA聚合酶將根據(jù)DNA模板中的堿基序列合成新的DNA鏈，同時將標記物結(jié)合到新合成的DNA鏈中。

5. 將反應產(chǎn)物進行電泳分離，根據(jù)標記物的不同熒光信號或放射性同位素的存在，確定DNA序列中的堿基排列順序。

在Sanger測序法的基礎上，將熒光信號接收器和計算機信號分析系統(tǒng)替代放射自顯影技術，使用熒光素標記替代32P或35S單一放射性核素標記，打開了DNA測序技術自動化的大門。

三、Sanger測序法的優(yōu)缺點

優(yōu)點：

1. Sanger是直接對DNA分子進行測序，適用于已知序列的驗證測序、文庫篩選、克隆鑒定、pcr重測序等。

2. 其zui大優(yōu)點在于讀取速度很高、高精確度，而且成本相對很低。相較于化學降解測序法，對于富含G-C的區(qū)域也不會影響測序效果。

缺點：

1. 必須有已經(jīng)序列設計測序引物，對于未知序列必須構(gòu)建克隆后才能測序，難以實現(xiàn)基因組水平的大規(guī)模測序。

2. 測定堿基序列需要大量wan全相同的DNA拷貝。

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