質(zhì)粒構(gòu)建的方法有哪些？

    細(xì)菌質(zhì)粒是DNA重組技術(shù)中常用的載體。通過基因工程手段將需要的外源基因送進(jìn)受體細(xì)胞中去進(jìn)行增殖和表達(dá)。將某種目標(biāo)基因片段重組到質(zhì)粒中，構(gòu)成重組基因或重組體。然后將這種重組體經(jīng)微生物學(xué)的轉(zhuǎn)化技術(shù)，轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞(如大腸桿菌)中，使重組體中的目標(biāo)基因在受體菌中得以繁殖或表達(dá)，從而改變寄主細(xì)胞原有的性狀或產(chǎn)生新的物質(zhì)。那么你知道質(zhì)粒構(gòu)建的方法有哪些嗎？讓我們一起來看看吧！

一、酶切連接

傳統(tǒng)意義上，質(zhì)粒重組是基于堿基互補配對的原理，一般做法為：

1）通過引物在目的片段兩端引入酶切位點；

2）用相同的限制性內(nèi)切酶分別對目的片段和載體進(jìn)行酶切處理；

3）目的片段和載體的酶切產(chǎn)物在體外連接；

4）連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌；

5）篩選重組子。

在實驗中，我們的每一步都需要根據(jù)該目的基因與載體的特性調(diào)整實驗；考慮到后續(xù)實驗，在選擇載體時務(wù)必要滿足與宿主細(xì)胞兼容且容易檢出的條件；

二、Gateway技術(shù)

    高通量基因克隆技術(shù)（Gateway Cloning Technology），是由Invitrogen公司在二十世紀(jì)九十年代末發(fā)明并應(yīng)用于分子生物學(xué)基因克隆的一項zhuan利技術(shù)。它利用專有的重組序列使得DNA片段能夠更有效地被轉(zhuǎn)入質(zhì)粒當(dāng)中，可應(yīng)用于大片段的基因克隆，并且在保持正確閱讀框的前提下讓不同表達(dá)載體間的DNA轉(zhuǎn)移成為可能。

    這一技術(shù)在插入的目的DNA片段兩端整合att L1和att L2兩個側(cè)端重組序列（Flanking Recombination Sequence），來構(gòu)建一個類似通道的結(jié)構(gòu)并稱之為“入門克隆"（Gateway Entry Clone），可以避免目的片段內(nèi)存在切點的問題而使得大片段DNA保持其完整性，大大提高了克隆效率，常應(yīng)用于大規(guī)模的DNA片段整合進(jìn)同一種表達(dá)載體，因此稱之為高通量基因克隆技術(shù)。

三、LIC技術(shù)

    Ligation-Independent cloning，簡稱LIC。采用LIC方法的pET載體是線性化的，在末端有12-15個突出的堿基以在退火時和目的片斷互補。在設(shè)計PCR擴增引物時加入與LIC載體互補的序列，PCR產(chǎn)物用3’→5’的內(nèi)切酶消化出單鏈與載體互補的序列。通過這種方式就可以把目的片斷定向、高效地插入LIC載體上。一般的pET載體是先在不含DE3片段的菌株中進(jìn)行克隆篩選，之后再把陽性克隆轉(zhuǎn)化進(jìn)入表達(dá)菌株，如BL21（DE3）中，通過IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)。

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