如何對(duì)pcr結(jié)果進(jìn)行分析?

一、PCR結(jié)果分析的基本步驟：?

1.基線設(shè)置?：實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)的基線是指在PCR的初始循環(huán)期間的信號(hào)水平，通常是3至15個(gè)循環(huán)之間，此時(shí)熒光信號(hào)幾乎沒有變化，可以認(rèn)為是背景或反應(yīng)的噪音。

2. ?閾值設(shè)定?：?qPCR的閾值代表的是明顯超出基線的擴(kuò)增信號(hào)水平，用以區(qū)分明確的擴(kuò)增信號(hào)和背景。通常qPCR儀器自帶軟件會(huì)自動(dòng)將閾值設(shè)置為基線熒光值標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。

3. ?CT值計(jì)算?：Ct是指熒光信號(hào)超過閾值時(shí)對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)，Ct值與目的基因的起始量成反比，可用于計(jì)算DNA初始拷貝數(shù)。

4. ?擴(kuò)增曲線分析?：擴(kuò)增曲線有兩種展現(xiàn)形式，一種是線性，一種是對(duì)數(shù)形式。通常用CT來推算樣品中樣品的濃度，CT值越高說明模板濃度越低。

5. ?標(biāo)準(zhǔn)曲線?：將已知濃度的樣品（標(biāo)準(zhǔn)品）經(jīng)過梯度稀釋后分別取樣進(jìn)行熒光定量PCR，得到的一系列Ct值與Log模板數(shù)對(duì)應(yīng)可以得到一個(gè)相關(guān)的曲線，即標(biāo)準(zhǔn)曲線。這個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以用來判斷熒光定量PCR體系的優(yōu)劣。

6. ?熔解曲線分析?：PCR產(chǎn)物進(jìn)行逐步升溫監(jiān)測(cè)，可以看到在達(dá)到其解鏈溫度時(shí)，熒光信號(hào)會(huì)有一個(gè)忽然的下降。理論上如果PCR得到特異性產(chǎn)物則只有一個(gè)Tm值，在溶解曲線上表示只有單峰存在。如果是多相峰，可以判斷產(chǎn)物不是單一的，發(fā)生了非特異擴(kuò)增。

二、不同PCR技術(shù)的結(jié)果分析方法

1. ?第一代PCR技術(shù)?：采用瓊脂糖電泳的方式對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分析，通過電泳判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，用于臨床檢測(cè)。

2. ?第二代PCR技術(shù)?：熒光定量PCR（qPCR），通過設(shè)置基線、閾值和CT值進(jìn)行定量分析，適用于需要精確測(cè)量DNA或RNA含量的實(shí)驗(yàn)。

3. ?第三代PCR技術(shù)?：以微滴化處理步驟為主要特征，提高了檢測(cè)的靈敏度和特異性，適用于更復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)需求。

三、具體實(shí)驗(yàn)操作步驟

1. ?樣品處理?：將樣品進(jìn)行稀釋和離心處理，確保DNAwanquan裂解和分離。

2. ?PCR反應(yīng)?：按照試劑盒說明書操作，將反應(yīng)管與凍干成分一起離心，添加緩沖液和引物/探針/核苷酸混合物，進(jìn)行PCR反應(yīng)。

3. ?結(jié)果分析?：通過基線、閾值、CT值和擴(kuò)增曲線等參數(shù)分析PCR結(jié)果，比較實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的差異，確定基因表達(dá)的變化。

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