封閉液的選擇主要基于抗體和目標(biāo)蛋白，日常內(nèi)參，還有一些本底豐度比較高的蛋白用脫脂牛奶封閉沒問題；磷酸化蛋白可采用BSA，如若豐度很低，或測(cè)上清分泌蛋白個(gè)人比較推薦使用成品快封，脫脂牛奶和BSA效果其實(shí)都不太穩(wěn)定。

?封閉液主要有以下幾種：脫脂奶粉、牛血清白蛋白（BSA）、血清、明膠和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）。

一、5%脫脂牛奶

封閉時(shí)間：室溫1-2h或者4度過夜。

脫脂奶粉zui常用和便宜的封閉劑，通常使用濃度為2.5%-5%。其優(yōu)點(diǎn)是經(jīng)濟(jì)實(shí)惠且效果良好，但缺點(diǎn)是如果目標(biāo)蛋白被磷酸化，則不應(yīng)使用脫脂奶粉，因?yàn)榕Ｄ讨械睦业鞍讜?huì)與抗磷酸化抗體結(jié)合，導(dǎo)致非特異性結(jié)合和高背景信號(hào)?。

一般5%脫脂牛奶pH大約為6.0左右，有些研究稱脫脂奶粉需調(diào)PH到7.4左右，但是大多數(shù)抗體不調(diào)pH也可以做出來，封閉后可采用1*TBST漂洗10分鐘再孵育一抗。

??注意事項(xiàng)：

1、日常保存放4度，變質(zhì)析出后不要再繼續(xù)使用，配置新的5%脫脂奶粉。

2、配置新的5%脫脂奶粉時(shí)可用磁力攪拌使其充分溶解，充分溶解后再使用。

二、BSA（牛血清白蛋白）

BSA是從牛血清中提純的白蛋白，通常使用濃度為2%-5%。優(yōu)點(diǎn)是純度較高，不容易產(chǎn)生非特異性結(jié)合，適合對(duì)背景要求嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)。缺點(diǎn)是BSA制劑可能含有磷酸化酪氨酸，會(huì)引起抗磷酸酪氨酸抗體的高背景，且與凝集素探針不相容。

?封閉時(shí)間：室溫1h，對(duì)于一些背景非常高的抗體，可以4℃過夜。

除了脫脂奶粉之外，比較常用的封閉劑，濃度可選2-5%。

磷酸化蛋白建議采用BSA或快封，BSA效果不穩(wěn)定，如果使用BSA封閉一般，可以試試用快速封閉液。

三、全血清

通常使用的濃度為 5-10%

使用率較低，價(jià)格昂貴。

對(duì)比脫脂奶粉和BSA也沒有什么好處，一般不選擇。但血清可以封閉掉一抗及二抗和樣本Fc受體之間的結(jié)合，BSA無法封閉Fc受體。

四、成品快速封閉液

封閉時(shí)間很快，基本只需要10-15min即可，也有一些是需要30min。

每個(gè)成品封閉液都有自己的Protocol，基本照做就沒問題。

成品快封通常含有提純過的蛋白，這種封閉液比脫脂奶粉和BSA好的地方是里面不含有各種亂七八糟的增強(qiáng)背景的蛋白成分。

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