小分子蛋白的WB該如何？

WB（WesternBlot）是一種常用的生物化學實驗技術，用于檢測和分析蛋白樣品中特定蛋白質的存在和表達水平。它通過將樣品中的蛋白質分離并轉移到膜上，然后使用特定的抗體識別目標蛋白，并通過化學或免疫檢測方法來可視化這些蛋白質。WesternBlot技術通常包括樣品制備、SDS-PAGE電泳分離、蛋白轉印、封閉和抗體檢測、曝光顯影等步驟。目前WB被廣泛應用于生物醫(yī)學研究中，用于研究蛋白質表達、翻譯后修飾以及蛋白質相互作用等。

圖1.WB流程圖

在日常實驗過程中，小分子蛋白是非常常見的，小分子蛋白是指待檢測的蛋白分子量小于20kda，常見的凋亡蛋白如Bcl2、Caspase-3、Bax，自噬相關蛋白如LC3B等均為小分子蛋白，這類蛋白由于較小的分子量，易受到凝膠網(wǎng)孔的影響在電泳過程中彌散，導致難以分離和檢測。因此，為了檢測到小分子量的蛋白，需要對實驗步驟進行一些優(yōu)化，以提高實驗成功率。

1. 配膠：整體配膠遵循蛋白分子量越小膠濃度越大的原則，對于小分子蛋白來說，分離膠濃度一般為12%-15%，對于小分子蛋白條帶可以分的更加清晰。同時在倒膠時濃縮膠的比例可以適當增加到4：6，使其充分濃縮，后續(xù)電泳過程中一定程度上可以減少彌散。15-20kda可選擇12%的凝膠；10-15kda可選擇13.5%的凝膠；小于10kda的蛋白用15%的凝膠或者用Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳體系。與傳統(tǒng)的Gly-SDS-PAGE相比，Tricine-SDS-PAGE使用三羥甲基氨基甘氨酸（Tricine）代替甘氨酸（Gly），具有更好的小分子蛋白分離效果。

2. 上樣：根據(jù)日常上樣經(jīng)驗，建議在跑小分子蛋白時增加1倍上樣量，防止蛋白彌散過多。選擇marker時，選擇適用于小分子蛋白的marker，后續(xù)敷抗體時可以更清楚的進行裁膜。電泳開始前可用1′loadingbuffer補齊未點樣的膠孔，防止兩邊不齊跑成“八"字。

圖1：賽默飛marker示意圖（左：常規(guī)蛋白marker；右：小分子蛋白marker）

3. 電泳：濃縮膠部分設置恒壓70V、30min左右，一般即可濃縮到一條線上之后調大電壓至110V，至所需蛋白區(qū)域全部分開為止。盡量避免長時間低電壓跑膠，易導致蛋白彌散過多。同時整個電泳過程中注意降溫。

4. 轉膜：由于小分子蛋白分子量小，吸附能力弱，因此轉膜時選擇0.22μm的PVDF膜，常規(guī)0.45μm膜容易穿透，剩余條件同正常蛋白一般可以滿足條件。

5. 封閉：快速封閉液或脫脂牛奶按正常條件封閉即可。裁膜時根據(jù)marker上下留出足夠多的空間。

6. 一抗孵育：在保證上述條件的基礎上，一抗是出好結果的關鍵一步，若沒前期實驗經(jīng)驗，一抗的稀釋比一般按照說明書配置，若有前期實驗的經(jīng)驗，可適當進行比例調整，一抗?jié)舛冗^高最后顯影階段易出現(xiàn)雜帶，過低則可能看不到條帶。使用1′TBST緩沖液稀釋，4℃孵育過夜。

7. 后續(xù)二抗比例及孵育時間、顯影按常規(guī)操作即可。需要注意若抗體不好用或者蛋白難出結果，在敷完一二抗時可適當延長洗膜時間及次數(shù)。

注意事項：

1. 轉膜時，若蛋白分子量過小，可適當提高甲醇比例（30%左右）改善吸附能力。

2. 跑小分子蛋白時marker盡量不跑到一張膜上，對于常見內參GAPDH、Actin及Tubulin等來說，分離膠濃度大上述蛋白區(qū)域一般分不開或分離不完整，易導致內參不齊。

天津益元利康生物科技有限公司：

一、輻射五大服務方向：

  1.國內試劑耗材經(jīng)銷代理；

  2.國外試劑訂購（直訂，或境外代理）；

  3.基因組測序（二代，二代+三代）；

  4.基因分型（SNP檢測）：低/中/中 高通量項目；

  5.生物樣本運輸（國內、）；

二、多家代理品牌，涉及30多種較有名品牌，經(jīng)營代理500多個品牌：

Qiagen、Sigma、R&D、Epigentek、ThermoFisher、DNA Genotek、USA Scientific、Matreya、Sage Science、List Labs、Macrocyclics、Steraloids、NIBSC、mobio、immunodx、cellsystems、medicago、abcam、CST、Roche、Bethyl、sino Biological、clodrosome、adi BIO-WORLD、TOKU-E、HYPHEN BioMed、moltox、ZeptoMetrix、International Humic、biocytex、Toxin Technology  、Streck、Elastin、biomax、Orflo Technologies、Accegen、Advbiomart、genlantis、R&D、Cygnus Technologies LLC、Enzyme Research、Bio/Data Corporation、Greer Lab 、Solarbio、bangslabs、bioline、musechem、Novocastra stemrd、hyphen-biomed、polyplus、moltox 、exiqon、pentapharm、verichemlabs、GenStar、ALZET、lucernatechnologies 、meridian、origene、zimmerpeacocktech、horizondiscovery、Reagents、megazyme、elisasystems………

  所有生物試劑耗材都可以進口，特別是冷門品牌，均能給客戶購買到。價格優(yōu)，貨期短，可加急，快10天到貨；保證服務質量，所有產品均提供售后服務。大部分客戶我們提供貨到付款服務，

  公司自成立依靠過硬的服務和良好的信譽與各大企事業(yè)單位、科研單位建立長期合作。客戶包括北大，清華，地大，中科院各所，各大藥企等等。

  專業(yè)訂購國內外試劑耗材，常備現(xiàn)貨，一手貨源，歡迎合作。