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        農桿菌感受態細胞的制備

         更新時間:2025-03-24    點擊量:480

        引言:

        農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)是植物基因工程中重要的載體工具,其感受態細胞的制備質量直接影響外源基因的轉化效率。本文將詳細介紹農桿菌感受態細胞的標準化制備流程,結合實驗優化技巧與注意事項,助您提升轉化成功率,滿足科研與產業化需求。

        一、什么是農桿菌感受態細胞?

        感受態細胞指通過物理或化學處理使細菌處于易于吸收外源DNA的狀態。農桿菌感受態細胞的制備是植物轉基因實驗的關鍵步驟,直接影響Ti質粒的轉化效率。目前主流方法為CaCl?化學法,具有成本低、操作簡便的優勢。

        二、實驗材料準備

        菌株選擇:常用EHA105GV3101等致病性缺失型農桿菌

        培養基:YEB液體培養基(配方:5g/L牛肉膏,1g/L酵母提取物,5g/L蛋白胨,5g/L蔗糖,0.5g/L MgSO?·7H?OpH7.0

        試劑:無菌0.1M CaCl?溶液、液氮、50%甘油

        設備:超凈工作臺、離心機、恒溫搖床、-80℃冰箱

        三、分步制備流程(含關鍵參數)

        步驟1菌種活化與擴增

        -80℃保存的農桿菌劃線接種于YEB固體培養基,28℃倒置培養48小時

        挑取單菌落接種至5mL YEB液體培養基,28℃200rpm振蕩培養16-18小時

        優化提示:OD???0.4-0.6時菌體處于對數生長期,此時收獲細胞活性最佳

        步驟2菌體收集與預冷處理

        將菌液轉移至預冷的50mL離心管,冰浴10分鐘

        4℃5000g離心10分鐘,棄上清

        加入10mL預冷0.1M CaCl?溶液,輕柔重懸菌體

        冰浴30分鐘,再次4℃離心10分鐘

        關鍵點:全程保持低溫(0-4℃),防止菌膜結構受損

        步驟3感受態細胞制備

        棄上清,加入2mL預冷0.1M CaCl?溶液(含15%甘油)

        輕柔吹打重懸,分裝至1.5mL離心管(每管100μL

        液氮速凍1分鐘后轉入-80℃長期保存

        配方優化:添加終濃度10mM MgCl?可提升DNA結合效率

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