電泳后檢測蛋白是否遷移正確與平均，可采用鋅染(負(fù)染)、膠染(blue silver)或考馬斯藍染色檢測，如果凝膠中的蛋白需要進行轉(zhuǎn)膜則需可逆的鋅染法，否則可以采用不可逆考馬斯亮藍法染色。雜交膜的選擇是決定 Western blot 成敗的重要環(huán)節(jié)。應(yīng)根據(jù)雜交方案、被轉(zhuǎn)移蛋白的特性以及分子大小等因素，選擇合適材質(zhì)、孔徑和規(guī)格的雜交膜。
用于 Western blot 的膜主要有兩種：硝酸纖維素膜(NC) 和PVDF 膜。膜是蛋白印跡實驗的標(biāo)準(zhǔn)固相支持物，在低離子轉(zhuǎn)移緩沖液的環(huán)境下，大多數(shù)帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)會與膜發(fā)生疏水作用而高親和力的結(jié)合在一起，但在非離子型的去污劑作用下，結(jié)合的蛋白還可以被洗脫下來。根據(jù)被轉(zhuǎn)移的蛋白分子量大小，選擇不同孔徑的膜。因為隨著膜孔徑的不斷減小，膜對低分子量蛋白的結(jié)合就越牢固。通常用 0.45μm 和 0.2μm 兩種規(guī)格的膜。大于20kD 的蛋白可用 0.45μm 的膜，小于20kD 的蛋白就要用 0.2μm 的膜了，如用 0.45μm 的膜就會發(fā)生“Blowthrough”的現(xiàn)象。常用于 Western Blot 的轉(zhuǎn)移膜主要是硝酸纖維素(Nitrocellulose, NC)膜和聚偏二氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride, PVDF)膜，此外也有用尼龍膜、DEAE 纖維素膜做蛋白印跡。尼龍膜和 NC 膜的特點相似，主要用于核酸雜交。雜交膜上有很多非特異性的蛋白質(zhì)結(jié)合位點，為防止這些位點與抗體結(jié)合引起非特異的染色和背景，一般用惰性蛋白質(zhì)或非離子去污劑封閉膜上的未結(jié)合位點來降低抗體的非特異性結(jié)合。封閉劑應(yīng)該封閉所有未結(jié)合位點而不替換膜上的靶蛋白、不結(jié)合靶蛋白的表位，也不與抗體或檢測試劑有交叉反應(yīng)。
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